黑色素瘤是一种起源于黑色素细胞的高度恶性肿瘤，可发生于皮肤、黏膜、肢端、眼等不同部位。由于存在高度异质性，临床表现各异，治疗效果较差。BRAF靶点的发现为恶性黑色素瘤的治疗带来了突破性进展，特别是达拉非尼联合曲美替尼双靶治疗为黑色素瘤患者带来了更好的生存获益。特别邀医院/同医院的刘业强教授、浙江大医院的滕晓东教授、医院的邢晓明教授、医院的徐紫光教授，共同就黑色素瘤BRAF检测的临床经验进行分享。
不同亚型BRAF突变率各不相同，但均建议进行BRAF检测
刘业强教授：黑色素瘤的诊断已经从既往经典的临床病理诊断发展到现在的分子诊断，不同类型黑色素瘤的检出率也各不相同。就中国人群而言，黑色素瘤主要以肢端型和黏膜型为主，而高加索人群则以持续光损伤引起的面部恶性雀斑样黑色素瘤和间断光损伤引起的浅表播散型黑素色瘤为主。对于持续光损伤导致的基因点突变，BRAF突变检出率要明显高于肢端型和黏膜型。
BRAF突变是肿瘤生物学行为的重要指标，影响着治疗决策
滕晓东教授：黑色素瘤本身就是一种高度恶性的肿瘤，不论发生于何种部位，不同部位BRAF突变的检出率各不相同。按照传统的理念，黑色素瘤的恶性程度在组织形态上主要看有没有溃疡的产生、有丝分裂率如何。根据以往的文献报道，一般而言如果存在BRAF突变，则以后突变都持续存在，而突变的肿瘤其核分裂和溃疡的发生率明显高于没有突变的肿瘤。因而按照传统形态来说，BRAF突变与肿瘤预后差相关。而对于转移性肿瘤，一般还需检测乳酸脱氢酶（LDH）水平，这是黑色素瘤转移的重要指标。在BRAF突变黑色素瘤中，LDH的水平通常也是上升的。概而言之，即BRAF突变与肿瘤组织形态学和预后相关，是预示肿瘤生物学行为的重要指标。
刘业强教授：诚如滕教授所言，BRAF突变与溃疡、转移等肿瘤生物学行为相关，但对于这种基因的关联，目前并没有大样本的研究证实，这需要后续进行相关研究。就皮肤科而言，日常接触较多的是肢端型黑色素瘤，在我们中心前期开展的检测中，BRAF突变率约达17%，占一定比例。
BRAF检测简单便捷，确诊后均应进行检测
滕晓东教授：就BRAF突变性质而言，一旦突变产生，就持续存在。要想全面了解患者的预后情况，应在明确诊断后就进行BRAF基因检测，以便为后续靶向治疗和免疫治疗提供依据。对于早期没有进行检测的患者，如果出现转移，BRAF基因的检测就更为重要了，此时应当进行BRAF基因检测。
其实BRAF检测相对比较简单，因为是单个基因的检测，所以既可以应用免疫组化筛查其蛋白表达，也可以进行基因检测，检测方法简单，速度也很快，目前临床已经逐渐普及。
合适检测标本各有要求，转移灶与原发灶存在空间异质性和时间异质性
邢晓明教授：对于标本的选择，不管是黑色素瘤抑或肺癌、结直肠癌等其他实体瘤，国际上的各种指南均明确指出组织标本为基因检测的首选标本，尤其对于初发患者而言，应对石蜡包埋的组织进行评估。此外，对于肿瘤含量也需进行评估，一般而言肿瘤含量在20%以上的组织就可以进行BRAF基因检测。当然，我们科室对其要求会更为严格。
此外，还需考虑到检测平台的不同。如果要进行二代测序（NGS），肿瘤细胞比例应大于50%；如果采用PCR方法，则肿瘤细胞需不低于个，如果低于这一标准，在检测之前需对肿瘤组织进行富集。对于经治患者，如果组织标本难以获取，如发生在内脏器官中，指南指出血液标本或体液标本亦是不错的选择。
由于肿瘤具有异质性，其原发灶与转移灶的分子改变已被公认存在差异，有研究表明，转移灶中BRAF突变阳性率高于原发灶。美国NCCN指南建议，对于转移性黑色素瘤患者进行靶向治疗前，首选转移灶进行活检评估和多基因检测。就我个人意见，首诊时既有原发灶又有转移灶者，两个病灶都要同时进行基因检测，以协助诊断及后续治疗方案的制定。如果经治患者出现转移灶，则可对转移灶进行基因检测以明确其耐药机制，并决定后续精准的治疗方案。
徐紫光教授：几乎所有肿瘤都存在异质性问题，尤其是原发灶与转移灶是不同部位者存在着空间异质性。除外空间异质性，还存在时间异质性，即随着肿瘤发生发展的不同阶段，肿瘤细胞的分子遗传学也会发生改变。因而恶性黑色素瘤的不同病理亚型，转移灶与原发灶的BRAF检测异质率是不同的，通常淋巴结及内脏转移与原发灶的BRAF检测异质性更高一些，而脑转移、皮肤转移病灶与原发灶的异质率相对低一些。所以我们一般建议在原发灶和转移灶同时存在的情况下同时获取、同时检测；如果患者为初次诊断，没有转移灶可取，建议先检测原发灶。如果原发灶不存在基因突变，也不能完全排除转移灶没有基因突变的可能。
刘业强教授：对于中国人群而言，约有50%的比例为肢端型黑色素瘤，其中有20%~30%的比例为甲下型黑色素瘤。对于甲下型黑色素瘤很难进行基因检测，医院，对于标本检测的一致性也很差。倘若没有很典型的临床表现，其在病理上很难诊断，如果要进行分子诊断，由于肿瘤细胞含量不达标，所以肢端型黑色素瘤在基因检测中又丢失了相当多的比例。
BRAF不同检测手段各有优劣，个体化选择合适方案
徐紫光教授：目前BRAF检测常规使用ARMS-PCR方法，其优势是灵敏度较高、技术相对成熟、稳定性较好，其阳性检出率基本与报道的BRAF突变率25%相一致，并且价格相对便宜，很多患者都能够接受。但其缺点也比较明显，因为目前市场上采用ARMS法的BRAF试剂盒，几乎都以VE为主，基本都是单检。而众所周知，BRAF抑制剂不仅可以应用于VE突变的患者，对于VD、VK等突变的患者亦可使用，尽管VE突变占据了绝大多数。简而言之，ARMS法无法完全覆盖所有BRAF突变的患者，可能存在一部分漏检。
第二种检测方法为NGS，其优点较为明显，可以覆盖BRAF突变的所有位点，并且还能同时检测恶性黑色素瘤中KRAS、NRAS、CKIT、PDGFRA等其他基因，为患者节约了时间和金钱。但NGS的缺点则是对检测人员要求较高，对于病理科医生和技术员而言都是一个挑战，医院都适合进行NGS检测。此外，NGS对标本要求较高，肿瘤细胞需达到很高的数量才会准确，如果肿瘤细胞数量比较低，检测结果可能还不如ARMS-PCR法。因而就检测方法的选择而言，需根据每个患者的实际情况选择相应的平台。
除外上述两种方法，还有一代测序，但目前并不推荐，一是检测试剂盒没有试剂注册证。二是对标本要求非常高。随着NGS的逐渐强势，一代测序在临床应用的空间越来越小。目前一代测序主要用于对NGS或ARMS法检测结果临界值时进行验证。而免疫组化方法仅用于初步筛查，不作为用药标准。
邢晓明教授：对于NGS与一代测序的问题，目前还涉及医保报销问题。
